使用抗體常見問題解答

1、如何選擇合適的一抗？

請先確定您要檢測的種屬和使用的實驗方法，然后查找相關產品，根據說明書上描述的“適用種屬和實驗方法”來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測的種屬和實驗方法均經過檢測，則您可以放心地購買該產品。
2、如何選擇合適的二抗?

二抗的選擇原則：

• 針對一抗來源的二抗（比如一抗是小鼠來源的，二抗就要是抗小鼠的）
• 針對一抗Ig亞型的（比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗體）
• 為了增加特異性、降低背景：可以選擇Fab段的抗體（去除Fc段的）、經過標本來源種屬血清吸附的的二抗
• 查看二抗的說明書，選擇經過驗證可以用于相應實驗方法的二抗

3、 如何選擇同型對照？

同型對照的主要目的是確定一抗的結合是特異性的，而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對照要與一抗的來源、Ig分型和標記*一致。例如：一抗是FITC標記，其抗體分型是小鼠的IgG1，則同型對照要選擇是FITC標記的小鼠的IgG1。

多抗的同型對照：

絕大部分的同型對照產品都是單克隆抗體，因此不適用于作為多克隆抗體的對照（因為多抗含有多種IgG的亞型）。
4、如何選擇陽性對照?

陽性對照的使用是一個實驗中確定抗體及檢測系統是否正常工作的依據，也是確定待測標本中是否存在待測蛋白的一個依據！尤其是檢測的標本是不確定是否有待測蛋白表達時。因此當實驗沒有陽性結果出現時，的選擇是實驗合適的陽性對照。

說明書上都有推薦的陽性對照。但是如果說明書上沒有推薦時，請參考以下條款：

• 看看說明書中是否有Abreviews。任何被其他客戶成功檢測的組織、細胞或者裂解物均可以作為合適的陽性對照！
• 根據說明書上的Swiss-Prot 或 Omnigene 數據庫來查找。這些數據庫經常會列出該蛋白表達的組織，這也可以作為合適的陽性對照！
• 查查該蛋白的GeneCards 吧，這里通常會有蛋白在不同組織的表達水平。
• 如果上述方法還是不能找到合適的陽性對照，推薦您去PubMed 查查發表文章，看看有無文章報道該蛋白表達的細胞和組織

5、如何確定一抗的稀釋比例?

如果說明書中有推薦的稀釋比例，請按照該稀釋比例進行實驗。但是由于標本類型、實驗條件、操作環境等各種因素的影響，推薦濃度僅作為參考。實驗者需要在推薦濃度周圍進行多個濃度梯度的實驗，從中發現*的稀釋比例。

如果說明書沒有推薦稀釋比例，僅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的預實驗來摸索*的比例了。下表列出的純化抗體抗體用于不同實驗方法時常用的工作濃度，可以作為預實驗的參考。未純化的抗體一般在說明書中不會標明抗體的濃度，因為大部分全抗血清、培養上清或腹水形式的產品濃度都是沒有經過測定的。如果未純化抗體產品的說明書中沒有標明其中特異性抗體的濃度，實驗者可以參考下表中“估計濃度”確定各種實驗稀釋比例。

請記住，下表中的各種稀釋比例和工作濃度僅僅是作為一個起始點，需要根據試驗結果來進行適當的調整。以此起點作一系列的濃度，從中確定*的工作濃度和稀釋比例！

6、如何確定適用于某種特定抗體的抗原修復方法？

有些抗體對抗原修復方式有特別要求的，一般在其說明書中都會有明確的標注和推薦。但是很多抗體并沒有一個特別的推薦，就需要實驗者自己來進行優化和摸索了。
7、為何實際檢測到的WB條帶與預期的有所區別？

WB是根據蛋白質的大小來分離蛋白的，通常小分子量蛋白在凝膠中的遷移速度要快。但是遷移率也是受到其他因素影響的，這就造成了實際檢測到的條帶與預期條帶的不一致。主要有以下幾種常見因素：

• 翻譯后修飾－比如磷酸化、糖基化等，這些修飾會增加蛋白質的分子量
• 翻譯后剪切－ 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執行功能時需要進行剪切成活化的形式，如pro-caspases
• 不同剪切體 – 有些來源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每個剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
• 相對電荷（Relative charge） – 氨基酸的組成（charged vs non-charged）
• 多聚體－如二聚體或三聚體。這些多聚體的形式通常會抵制WB時所做的還原條件，因此造成檢測的條帶偏大。