細胞冷凍和復蘇

基本原理：

   在長期的細胞培養過程中可能會出現微生物污染或基因型改變等情況，會導致具有優良特性細胞系的丟失。為防止這些細胞的丟失，細胞可以經快速冷凍并幾乎無限期保存在非常低的溫度下，如液氮（-176℃）。

試劑和設備：

冷凍液: 90%滅活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存；
培養液；
臺盼藍溶液（0.4%溶解于PBS）；
70%乙醇；
組織培養瓶；
15-50 ml 無菌圓錐底離心試管；
離心機；
血球計數板；
超凈工作臺；
光學顯微鏡；
37℃水浴；
冷凍管；
-80℃冰箱；
液氮和液氮容器。
操作步驟：

（一）冷凍細胞

1．收集對數生長期細胞；

2．以25μl臺盼藍溶液稀釋25μl細胞懸液；用血球計數板計數并計算細胞存活率（至少應該在90%以上）；

3．細胞懸液在4℃ 條件下200磄離心10分鐘；

4．將沉淀的細胞重新懸浮在冷凍液中（大約5?06細胞/0.5 ml 冷凍液）；

5．將細胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml；

6．將冷凍管置于-80℃冰箱中；

7．24小時后，將冷凍管移入液氮罐中；

8．在記錄本或電腦中記錄下每一個冷凍管的位置以確保在以后應用時能夠找到每一個冷凍管。

（二）細胞復蘇

1．將冷凍管迅速由液氮轉入到37℃水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時攪拌加速解凍；

2．當細胞*解凍后，用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒；

3．將解凍后細胞轉移到含4℃預平衡培養液的試管中；

4．細胞懸液在4℃下200磄離心10分鐘；

5．棄上清，將細胞重新懸浮在新鮮培養液中；

6．將細胞轉移到細胞培養瓶，CO2孵箱中培養；

7．是用倒置顯微鏡檢查細胞存活率以及細胞密度，如果細胞密度過高，用培養液稀釋至適宜濃度。

對照試驗

    在冷凍細胞被移入到液氮罐中一段時間后，取出一管細胞復蘇并進行培養以檢測存活率。

實驗要點及說明：

1．嚴格遵守液氮操作規則（即戴上合適的手套和護目鏡），液態氮對眼睛極為有害；

2．對一瓶細胞培養液要盡可能多分裝幾個冷凍管；

3．延長暴露在DMSO中的時間對細胞有害，因此冷凍和解凍操作要盡可能快；

4．細胞可以暫時穩定保存在-80 ℃達數月；

5．每批次冷凍和復蘇的細胞的存活率可能會不相同，為避免這個問題，每次細胞凍存分兩批以上進行；

6．DMSO可以防止在細胞內部出現冰結晶，凍存過程需要逐步降低溫度；

7．如果復蘇后細胞難以恢復到良好狀態，可以使用含10%鼠胚胎成纖維母細胞培養上清的培養液以促進恢復；

8．也可以用含20%熱滅活胎牛血清和10%DMSO的培養液為冷凍液。