RNA提取注意事項(xiàng)

一般注意事項(xiàng)

一些RNA提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒(méi)有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。
2、有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。
3、許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 許多生物材料在提取核酸時(shí)，都會(huì)遇到多糖的污染問(wèn)題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低。
     克服多糖污染可采用以下一些辦法
1） CTAB多次抽提。
2） 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對(duì)低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。
3）在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。
5、在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會(huì)殘留酚，而酚的存在將對(duì)核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。
6、 在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時(shí)，更要避免劇烈操作。
7、 在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。
8、 在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，－70℃下>30min;－20℃過(guò)夜將有助于增加核酸的沉淀量。
9、 在核酸提取過(guò)程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時(shí)復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲(chǔ)藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。
10、 核酸提取后可通過(guò)PCR 、RT－PCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫(kù)、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫(kù)扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫(kù)中篩選出完整基因。
11、 在抽提過(guò)程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。

針對(duì)酶的一些注意事項(xiàng)

防止RNA酶污染的措施：
1、 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3、 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4、 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。
5、  操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。
6、 設(shè)置RNA操作實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為。
7、 DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理
8、 加樣原則是DNAzui后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面，混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。
9、 普通實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個(gè)房間里有比較大的關(guān)系，zui容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。因此要格外注意一些。

常用的RNA酶抑制劑：
1、 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2、 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3、 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能*抑制RNA酶的活性。
4、 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5、其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。因?yàn)镈EPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA過(guò)程中不能使用，而且它與一些緩沖液（例如Tri）不能相容在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，zui關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。